固态核磁共振和MD模拟揭示了菱形蛋白酶抑制剂的绑定模式

菱形蛋白酶是intramembrane丝氨酸蛋白酶切割跨膜脂质双分子层内的基质。尽管菱形蛋白酶的结构特点已经彻底研究,es复杂的三维结构仍然是一个主要目标。大量的调查集中到目前为止大肠杆菌GlpG,菱形蛋白酶已成为一个模型系统。其晶体结构揭示了一个六跨膜螺旋(TM)的核心从力学上看连接，由几个重要的循环。催化丝氨酸组成的双201 (TM4)和组氨酸254 (TM6)面临的酶深深埋在细胞外的一面。它仍在争论是否TM5充当移动衬底门,一个想法就是由一些研究揭示L4, TM5和L5动态热点。L1循环被认为是参与脂质双分子层内的酶的定位,而L5循环作为上限以上活性部位,并可能导致衬底绑定。衬底乳沟的模型提出了基于晶体结构与小肽抑制剂GlpG和MD模拟exosite衬底绑定。底物识别的确切机制、绑定和乳沟,然而,仍在争论。

图1 (一)晶体结构GlpG (PDB标识:2 ic8)和突出显示的结构特点(活性部位绿色、循环地区黄、跨膜螺旋2和5蓝色)。(B)和(C) 2-styryl-4的化学结构H3,1-benzoxazin-4-one (SBO, B)和7-amino-4-chloro-3-methoxy-1H2-benzopyran (JLK6 C)。SBO, JLK6抑制GlpG可逆和不可逆,分别。

菱形蛋白酶实现广泛的生物功能,因此代表了潜在的新药物靶点治疗一些危及生命的疾病,包括疟疾、糖尿病和帕金森病。Phosphonofluoridates,作为第一个被发现的抑制剂GlpG,其次是β-lactams/β-lactones,无论他们变成了大众化的弱粘结剂和不利的细胞生物学的应用程序。最近,糖精和benzoxazinones被证明具有更强的约束力的亲和力。此外,肽基ketoamides已建议作为药物开发的选择性,并承诺抑制剂。

抑制剂在结构生物学研究上下文通常依赖于protein-ligand复合物的结晶,这是非常具有挑战性的膜蛋白,需要洗涤剂模仿脂质环境。经常结晶也阻碍了添加抑制剂,可能会扰乱晶体。然而,固态核磁共振不需要结晶。蛋白质与配体及其相互作用可以在本土一样的条件下研究脂质双分子层,在生理温度和缓冲条件下。这是特别重要的,因为菱形蛋白酶是高度依赖于脂质环境,可以改变他们的分裂活动和特异性。

以前,我们已经表明,我们可以实现高质量、1GlpG H-detected固态核磁共振光谱的脂质体,使residue-specific结构和动态的调查。1H-detected固态核磁共振已成为一种有价值的方法,研究膜蛋白相比,由于更高的灵敏度13C上可用的附加信息检测和H / D交换和水的可访问性。在这里,我们使用它结合分子对接和分子动力学(MD)模拟调查GlpG抑制剂结合的影响。

光谱质量GlpG-inhibitor复合物相比略有减少apo-GlpG之一,这可能归因于蛋白质的构象异构引起的配体结合。我们还观察到,一些山峰失踪的光谱inhibitor-bound GlpG。识别哪些残留影响抑制剂绑定我们收购了,除了1H -15N 2 d光谱,三个3 d光谱:CαNH (H), (H) CONH和(H) CαNH(有限公司)。这足以转移我们先前发表的作业apo-GlpG GlpG-JLK6和GlpG-SBO。作为GlpG JLK6绑定不可逆转,我们可以添加透析前的配体步骤用于调整或GlpG之后插入一个脂双分子层。通过比较样品准备在这两个不同的方法我们获得有价值的信息关于残留,保护从H / D交换抑制剂具有约束力。样品中添加JLK6透析步骤期间,峰值对应催化二分体(S201和H254)和残留在附近(G199、L200 G202, V203, I255和G257)是不可见的。此外,山峰失踪所有残留控制螺旋(TM5),顶部的残留的TM3 (K191 F192和S193) H150 (TM2 oxyanion洞的一部分),W196 L4 (L3)和地区(Q220和L225)。出人意料地,两个残基的山峰远离JLK6的结合位点,I113 TM1的顶部和W136循环L1,也不见了。应该注意的是,W136菱形蛋白酶是一个高度保守的残留,形成了WR和R137。结果表明,突变的W136导致酶活性显著降低。

当JLK6透析后添加步骤有些山峰“再次”,因为在H / D交易所发生的时间没有抑制剂显示了2 d NCα预测的3 d (H) CαNH光谱apo-GlpG(左)和GlpG绑定到JLK6(右)与山峰时隐时现。所有的残留物和催化二分体,除了H254和I255样本中可见JLK6透析后添加。催化S201,仅作为apo-GlpG弱峰可见,似乎在GlpG绑定JLK6表明抑制剂稳定的支柱S201当绑定。F192 TM3可见的顶部是一个非常软弱,嘈杂的峰值,但K191 S193仍然是不可见的。仅供TM5 I237和L229随处可见,表明影响这一地区的动力学抑制剂绑定。

图2 抑制剂具有约束力的观察到固态核磁共振。(A) HNCα化学位移扰动(csp)之间GlpG独自GlpG绑定到JLK6绘制残留的函数。深蓝色酒吧表明残留不可见的光谱GlpG JLK6。(B)免受H / D交换的残留JLK6 (H150、F192 W196, S201, L229, I237和G257)的晶体结构绘制到GlpG绑定到JLK6 (PDB标识:)。Sidechains密切的空间JLK6显示为棒(H150、Q189 F197, S201, W236, F245和H254)。(C) 2 d NCα预测从3 d (H)/GlpG CαNH实验(左)和GlpG绑定到JLK6(右)与山峰时隐时现。(D)的晶体结构GlpG绑定到JLK6 (PDB标识:之间HNCαcsp GlpG单独和GlpG JLK6绘制到结构。CSPs颜色编码通过增加价值。残留的HN作业丢失所示灰色和残留的山峰已经消失的光谱GlpG绑定到JLK6深蓝色所示。

除了不同的H / D交换模式,我们分析了化学位移变化引起的抑制剂绑定(请参阅图2 a, D和表S4__对于H, N和Cα化学位移扰动(csp))。TM2的更低的部分(G163 L169), TM3 (G170 I175)和TM4 (L213 D218)是影响抑制剂具有约束力。最强的效应被残留I223循环L4,但L4的其余部分主要是未受影响。周围几个残留JLK6显示重要的化学位移变化的结合位点(Q189、F192 G199, L200, S201, N251, G252, A253和A256)。侧链的A182 S185、Q189 F197和A253 S1子站,酶的水潴留网站将水,从而使乳沟机制残留的TM2和TM5 exosite的一部分酶,促进了衬底的第一次接触。其他重要的接触点可以在L5 (如。L244-M247)不幸的是不可见的光谱,最有可能由于结构动力学在μs时间尺度引起构象异构性。此外,强烈影响几个残留在L1。大的csp建议当地环境的变化引起的抑制剂具有约束力。这可以通过直接与抑制剂的交互或变构效应。只有一个小结构重排TM5观察JLK6 GlpG晶体结构的束缚,但根据我们的数据的动态TM5都受到影响。因为大部分残留在TM5不可见光谱中我们不能得出结论是否TM5结构性变化发生,但那些是可见的(L229和I237),而小csp。与晶体结构,没有观察到显著的结构变化对L1,我们观察到一些残留的化学位移变化L1循环。疏水残基的突变(F133, F135 Y138, F139和L143)在L1直接脂质接触以前减少酶的活动,可能通过一个不稳定的脂质双分子层内的酶。也观察到许多残留的L1循环参与稳定氢键。H141 G199。此外,建议L1循环参与底物相互作用,形成了S4一起L3的残留物。可能的化学位移变化对L1源于我们观察重组的L1和脂质双分子层之间的相互作用。这样一个不会观察到晶体结构重排的洗涤剂可溶性缺乏一个脂双分子层膜蛋白,强调更多的本土一样条件下研究的重要性。然而,需要进一步的调查来澄清,确定性,生物结构重排在L1的重要性。最后,我们注意到一些额外的山峰抑制剂绑定仅在GlpG样本是不可见的。不幸的是不可能明确地分配这些山峰,但似乎他们源自GlpG灵活的地区变得更加严格的抑制剂具有约束力。

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